Nature | 空气可以直接充电？——将空气转化为电能的氢化酶Huc的结构解析
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土壤对大气中氢 (H2) 的氧化是塑造大气氧化还原状态的关键生物地球化学过程。之前这个过程被认为是一个非生物过程，但现在人们认识到，来自至少九个门的多种好氧细菌可以氧化大气中的 H2，并且每年从大气中去除的 H2 总量占 75%（约 60Tg）1。大气中的 H2 氧化为细菌在营养有限的土壤环境中之余提供了补充能量来源，使它们能够拥有混合营养生长类型或单独在空气中以休眠但可存活的状态长期生存。例如，分枝杆菌细胞和链霉菌孢子通过有氧呼吸链将电子从大气中的 H2 转移到 O2 从而以饥饿状态存活下来2。氧化大气中 H2 的能力广泛存在于来自不同环境的细菌中 3，一些生态系统（例如极度干旱的极地土壤）似乎主要由大气能源驱动。
目前尚且没有已知的化学催化剂可以氧化大气中的 H2，这将需要选择性氧化存在于含有高浓度 (21%) 催化毒物 O2 的大气中的低浓度底物 (530 parts per billion by volume (ppbv))4。第1组 [NiFe] 氢化酶构成膜结合H2氧化金属酶家族，支持细菌在富含H2的环境中的需氧和厌氧生长，然而，这些酶通常不能进行大气中的 H2 氧化，因为它们对 H2 的亲和力较低（米氏常数(Km) >500nM）并且会被 O2 可逆或不可逆地抑制。最近，研究者确定了来自第 1 组和第 2 组 [NiFe] 氢化酶的几个高亲和力谱系，它们可以将大气 H2 衍生的电子输入有氧呼吸链。全细胞研究表明，这些酶对 H2 具有明显更高的表观亲和力（Km 值为 30 至 200nM）并且似乎对 O2 的抑制不敏感5。然而，鉴于这些氢化酶尚未被分离，它们是如何进化以选择性的氧化 H2、可以暴露于 O2 而不被氧化并且与电子传输链相互作用仍然未知。值得注意的是，负责大气 H2 氧化的氢化酶是否具有固有的高亲和力，或者它们的亲和力是否通过它们与呼吸链的相互作用来调节仍存在争议。
为了解决这些知识空白，来自澳大利亚莫纳什大学的Chris Greening和Rhys Grinter实验室合作于2023年3月8日在Nature期刊上发表了题为“Structural basis for bacterial energy extraction from atmospheric hydrogen”的论文，文章解析了直接从好氧细菌耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis) 中分离得到的氢化酶 Huc 的冷冻电镜结构并探讨了其作用机制。这些发现为生物地球化学和生态学上十分重要的大气H2氧化过程提供了机制基础，发现了一种依赖于长距离醌运输的能量耦合模式，并为开发环境空气中H2氧化的催化剂铺平了道路。
研究者使用HucS亚基上的染色体编码的Strep-tag II从耻垢分枝杆菌中分离出Huc。SDS-PAGE 分析表明，Huc由三个亚基组成，分别对应HucL（约 58kDa）、HucS–2×Strep（约39kDa）和第三个未知亚基（约18kDa）的三个蛋白质亚基组成。质谱将这第三个亚基鉴定为未表征的蛋白质MSMEG_2261，它由 hucS17 上游的 huc 操纵子中的一个开放阅读框编码。正如之前在耻垢分枝杆菌细胞裂解物中观察到的 Huc，纯化的 Huc 复合物有大约 800–900kDa 的分子量。Huc 呈红棕色，与多个金属簇的存在保持一致，并且在室温下高度稳定，变性温度达到 78.3°C。因此反映了这种酶帮助细菌在最极端的环境中生存。
虽然Huc 可以氧化整个细胞中的大气 H2，但尚不清楚它是否具有固有的高底物亲和力，或者这种特性是否源于与呼吸电子传递链的耦合。为了解决这个问题，研究者测试了纯化的 Huc 在环境空气顶部空间中氧化3 至 100 (ppm) H2 的能力。研究发现Huc使用硝基蓝四唑 (NBT) 或醌类似物甲萘醌作为电子受体，迅速消耗 H2 ，使其低于气相色谱仪的检测最低值（约 40ppbv）。纯化的 Huc 的动力学分析表明（图1），它适用于氧化大气中的H2，具有高亲和力 (Km =129nM) 和低 H2 阈值 (<31 pM)，但周转缓慢（催化常数 (kcat) = 7.05 s−1）。Huc 的 kcat/Km is 5.4 × 107 M−1 s−1，表明该酶在低 H2 浓度下非常高效。纯化的 Huc 的动力学类似于将 Huc 作为唯一氢化酶的耻垢分枝杆菌突变体的动力学（Km =184 nM，阈值=133pM），表明氢化酶本身是全细胞 H2亲和力的主要决定因素。Huc 在环境空气中以低浓度氧化 H2 的能力也表明其对 O2 的抑制有很高的耐受性。通过在实验测量发现Huc 介导的 H2氧化在不同 O2 浓度下的速率或亲和力没有显着差异，表明 Huc 是一种 O2 不敏感酶（图 1c）。在没有替代电子受体的情况下，O2 通过 Huc 刺激 H2 氧化（图 1d），表明该酶可以将电子直接转移到 O2。
图 1 Huc是一种高亲和力的O2不敏感的氢化酶
研究者对纯化的 833kDa Huc复合物进行了冷冻电镜 (cryo-EM)研究。2.19Å 的结构展示了一个形似四叶草，通过茎状突起与膜囊泡相关联的结构。Huc 的四个“叶片”中的每一个都分别由两个 Huc原聚体组成，每个原聚体由 HucS 和 HucL 亚基组成（图 2a）。四个 Huc“叶片”与由四个 HucM 亚基形成的支架结合，HucM 是一种细长的 α-螺旋蛋白，交织在一起形成一个笼状结构（图 2b）。
图 2 Huc形成了包含HucS、HucL和HucM的833-kDa寡聚物
一致地，[NiFe] 活性位点的结构与之前报道的相同（图 3a）。HucS 的3 个铁硫簇的密度图和第四配位残基表明它们都具有[3Fe-4S] 构型（图 3b）。这得到了Huc 的电子顺磁共振 (EPR) 分析的支持，它产生的信号与多个自旋耦合 [3Fe-4S] 簇的存在一致，并证明了它们的氧化还原活性（图 3c) 。这与其他具有一个或多个 [4Fe–4S] 簇的特征氢化酶（包括 O2 耐受突变体）形成对比。[3Fe–4S] 簇通常在比 [4Fe–4S]2+/+ 簇高约+250mV 的电位下进行 +/0 氧化还原转化。由于电子转移链先前已被证明决定了其他氢化酶的催化偏差，因此 Huc 中的 [3Fe-4S] 簇的存在可能在调节酶的超电势方面起着重要作用。
图 3 Huc在环境条件下采用非抑制性Ni-B态，限制O2扩散到催化簇
Huc EM 图的分析揭示了每个 Huc 原聚体的远端 [3Fe-4S] 簇附近的额外密度，这可以明确地建模为甲萘醌（图 4a、b）。与此一致，质谱法证实 β-dihydromenaquinone-9 与纯化的 Huc 结合，占据率为 96.2%（图 4e）。甲萘醌的头部基团通过其氧基与 Tyr301的末端羟基和 Lys212 的主链羰基之间的氢键结合以及与 HucS 的 Tyr229 的 π-π 相互作用来稳定（图 4c）。结构中Tyr229 可采用与甲萘醌对应的密度冲突的第二种构象，它保护近端 [3Fe-4S] 簇免受溶剂影响，并可能在没有甲基萘醌的情况下减轻 O2 还原，这将导致形成活性氧（图 4d）。这些数据表明 Huc 直接结合并还原甲萘醌，这与甲萘醌作为 Huc 的首选电子受体一致（图 1c）。这与第 1 组 [NiFe] 氢化酶中的观察结果形成对比。然而，尽管有强有力的证据表明 Huc 直接将来自 H2氧化的电子提供给呼吸醌，但 Huc 不是一种完整的膜蛋白，因此高度疏水的膜结合甲萘醌必须被运输到其远离膜表面的94Å底物结合位点。对 Huc 低聚物结构的分析表明了这种情况发生的可能机制。Huc 内腔的内表面有 HucS 和 HucM 的疏水侧链，这有助于甲萘醌和其他疏水分子的结合，并且具有能够容纳甲基萘醌的尺寸（图 4f-h)。甲萘醌进出疏水室的通道可能是由膜相关的 Huc 茎提供的。总的来说，甲萘醌分子可能通过这个管道扩散到 Huc 疏水室中，在那里它们结合底物受体位点并在扩散回膜之前还原为甲萘醌，在那里它们被细胞色素 bcc-aa3 氧化酶末端氧化酶氧化以产生质子动力（图 4i）。在氢化酶中，这种醌还原机制是 Huc 所独有的，其他具有结构特征的呼吸氢化酶通过直接电子转移到完整的膜细胞色素 b 亚基来还原膜中的醌。
图 4 Huc从膜中提取并直接还原甲萘醌
综上，为了利用空气中存在的微量 H2，微量气体清除细菌的 [NiFe] 氢化酶需要与其在富含 H2或缺氧条件下起作用的对应物相比具有不同的特性。作者利用来自好氧细菌耻垢分枝杆菌的 Huc 的生化和电化学表征，表明所需的 O2 不敏感性和对 H2 的高亲和力是这种氢化酶所固有的，而不是由于与细菌细胞内的其他过程耦合而产生的。此外，通过解析Huc 的冷冻电镜结构、分子动力学模拟以及 FTIR 和 EPR 光谱，提供了强有力的证据，表明至少从活性位点部分排除 O2 会导致酶对 O2 不敏感。数据还表明，Huc 具有很大的电化学超电势，这使得它可以独特地调节微量 H2 的氧化，并将产生的电子直接供给呼吸辅助因子甲萘醌。值得注意的是，研究者证明 Huc 通过一种独特且非常不寻常的机制转运甲萘醌。通过支架蛋白 HucM，Huc 复合物可以从膜中提取甲萘醌并将其转运 94Å 到酶的电子受体位点。这一发现极大地扩展了我们对进行呼吸醌还原的可能性的认识。更广泛地说，鉴于迄今为止在全细胞和纯化酶系统中应用的所有氢化酶都是被 O2 抑制的低亲和力酶，这些发现为生物催化剂的开发开辟了道路。Huc 作为一种氧不敏感的高亲和力氢化酶，为开发在环境条件下运行的生物催化剂提供了基础。
原文链接
https://www.nature.com/articles/s41586
-023-05781-7
参考文献
参考文献
[1] Greening, C. & Grinter, R. Microbial oxidation of atmospheric trace gases. Nat. Rev. Microbiol. 20, 513–528 (2022).
[2] Koch, H. et al. Growth of nitrite-oxidizing bacteria by aerobic hydrogen oxidation. Science 345, 1052–1054 (2014).
[3] Bay, S. K. et al. Trace gas oxidizers are widespread and active members of soil microbial communities. Nat. Microbiol. 6, 246–256 (2021).
[4] Novelli, P. C. et al. Molecular hydrogen in the troposphere: Global distribution and budget. J. Geophys. Res. 104, 30427–30444 (1999).
[5] Greening, C., Berney, M., Hards, K., Cook, G. M. & Conrad, R. A soil actinobacterium scavenges atmospheric H2 using two membrane-associated, oxygen-dependent [NiFe] hydrogenases. Proc. Natl Acad. Sci. USA 111, 4257–4261 (2014).
供稿 | 谭佳鑫
审稿 | 肖媛
责编 | 囡囡
排版 | 可洲
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